Projeto Genoma da Xylella fastidiosa

     
      Em uma iniciativa inédita e de alto impacto na comunidade científica nacional e internacional a FAPESP financia o primeiro Projeto Genoma no Brasil e o primeiro de um organismo fitopatogênico no mundo, tendo sido escolhida a bactéria Xylella fastidiosa, agente causal da clorose variegada dos citros (CVC). Os fatores que levaram a FAPESP a induzir e apoiar um projeto dessa natureza incluem: a) necessidade de desenvolvimento da área de biotecnologia vegetal, principalmente capacitação de recursos humanos e melhoria de infra-estrutura; b) a competitividade internacional do setor agrícola brasileiro, muito bem representado pela citricultura; c) o amplo espectro de aplicações em áreas básicas e aplicadas, em problema de interesse brasileiro, principalmente; d) o desenvolvimento de interações e a formação de uma rede de colaboração; e) a inserção internacional de projetos dessa natureza; f) a disponibilidade de tecnologia de seqüenciamento em larga escala; g) o interesse e a participação do setor privado, com efetiva contrapartida financeira. 
        Em um processo de competição entre cem grupos no Estado de São Paulo foram selecionados 32 laboratórios, sendo que desses pelo menos sete são da área de Fitopatologia. Todos foram capacitados em equipamentos para todas as etapas do projeto, desde cultivo e transformação de bactérias, construção de biblioteca por "shut gun", mini-preparação de plasmídeos, seqüenciamento automático e análise dos resultados, montagem dos cosmídeos e anotação. Inicialmente foram selecionados três laboratórios com maior experiência em seqüenciamento que seriam responsáveis pelo treinamento de outros grupos e seriam também responsáveis pelo seqüenciamento completo do genoma, cada um utilizando-se de estratégias diferentes. A avaliação e o acompanhamento dos projetos ficaram a cargo de uma comissão de três pesquisadores estrangeiros com experiência em projetos dessa natureza e dois pesquisadores brasileiros, com a coordenação geral da FAPESP e participação do CNPq com bolsas tipo RHAE. 
        Para iniciar o seqüenciamento foi escolhido um isolado com comprovada patogenicidade, com o qual o postulado de Koch já havia sido fechado. Tão logo se iniciou o projeto ficou decidido que a melhor estratégia para todos os laboratórios seria o seqüenciamento de bibliotecas "shut gun" do DNA dos cosmídeos. Todas as bibliotecas de cosmídeos construídas foram-no única e exclusivamente com DNA desse isolado em um único ciclo de crescimento, reduzindo-se assim possibilidades de recombinação genética entre ciclos. Uma biblioteca de cosmídeos de 40 a 50 kb foi montada em Lawrist5 com uma cobertura de dez vezes o genoma, estimado na época em 2,1 Mb, e em colaboração com o grupo de Heildelberg, onde também se iniciou a construção do mapa físico. Cada laboratório iniciava o seqüenciamento de bibliotecas de plasmídeos, obtidas por fragmentação do DNA do cosmídeo por nebulização ("shut gun"). Iniciava-se a corrida para decifrar o genoma da Xylella fastidiosa.
        À medida que as seqüências eram produzidas, precisavam ser avaliadas quanto ao tamanho e à qualidade das bases, sendo então utilizadas para a montagem dos fragmentos maiores ("contigs") até a montagem completa do cosmídeo. Cada laboratório, em colaboração com o laboratório de Bioinformática, era encarregado da montagem de seus cosmídeos. Somente a partir da avaliação de qualidade a seqüência completa era validada e poderia receber o pagamento equivalente por parte da FAPESP. A montagem final do genoma ficou sob a responsabilidade do laboratório de Bioinformática. 
        O cronograma previa o término do projeto em maio de 2000. No entanto, após um ano, a rede ONSA (Organization for Nucleotide Sequencing and Analysis), consolidando um instituto virtual de pesquisa genômica, está com o projeto em fase final de montagem em função, principalmente, da forte interação e competição entre os diversos grupos envolvidos. Entre esses estão incluídos laboratórios do Instituto Agronômico, do Instituto Biológico, da ESALQ e CENA/USP, UNESP/Botucatu e Jaboticabal e algumas universidades particulares, todas do Estado de São Paulo. A participação do Fundecitrus foi um dos fatores de estímulo ao projeto. A coordenação de DNA está a cargo do Instituto Ludwig e a de informática, do Laboratório de Bioinformática da Unicamp. 
        Nessa etapa final do projeto observa-se que o genoma completo da bactéria está em torno de 2,4 a 2,6 Mb, com um mega-plasmídeo e um mini-plasmídeo de 50 kb e 1,2 kb respectivamente. Pelo número de seqüências submetidas ao laboratório de Bionformática pode-se assegurar que o genoma já está coberto pelo menos 30 vezes. Seqüências de transposons e de fagos foram também já identificadas no genoma. A anotação de todos os ORFs ("open read frames") está em processo de conclusão, demonstrando regiões de grande homologia com outros genomas de bactérias. 
        Concomitantemente ao seqüenciamento iniciou-se a análise funcional do genoma no sentido de descobrir quais as funções dos genes e de que modo eles podem ser utilizados como alvo no controle da bactéria. Não só por uma análise direta desses genes por técnicas de indução de mutação, como também por analogia com genes já conhecidos de outros organismos, alguns deverão ser selecionados para serem utilizados como alvo visando ao controle. É o projeto Genoma Funcional, já em andamento. É importante destacar que essas e outras informações geradas no Projeto Genoma serão de fundamental importância no desenvolvimento de todas as estratégias futuras de controle desse importante patógeno dos citros. Sem informações dessa natureza não seria possível desenvolver um efetivo controle dessa bactéria, cujo potencial de prejuízo é de amplo conhecimento da citricultura. 
        Sem dúvida o Projeto Genoma pode ser considerado um marco no ciência brasileira e, especialmente, da Fitopatologia brasileira. Ao lado de sua capacidade de formar recursos humanos, abre novas abordagens de conhecimento e controle de doenças de plantas. 
        Outras informações sobre a rede ONSA podem ser encontradas em http:\\www.fapesp.br. 

Marcos Antônio Machado
Instituto Agronômico, Centro de Citricultura Dr. Sylvio Moreira 
fone: (19) 546-2589